Το αντι-Leu-7 είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα, το οποίο αρχικά θεωρήθηκε ότι αντιδρά μόνο με φυσιολογικά "φονικά" κύτταρα¹. Ωστόσο, επόμενες μελέτες έδειξαν ότι το αντι-Leu-7 αντιδρά, επίσης, με εμμύελες ίνες του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος², με νευροενδοκρινείς όγκους και όγκους του συστήματος APUD³, με το φυσιολογικό και νεοπλασματικό επιθήλιο του προστάτου^4-6, με το επιθήλιο των ιδρωτοποιών αδένων⁷, καθώς και με διάφορα αδενοκαρκινώματα⁴. Σχετικές μελέτες στο θυρεοειδή δείχνουν ότι, το αντίσωμα αυτό θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης στη διαφορική διάγνωση καλοήθων και κακοήθων όγκων του αδένος^2,8.

Για να διερευνήσουμε αυτή την υπόθεση, μελετήσαμε ένα ευρύ φάσμα πρωτοπαθών και μεταστατικών όγκων του θυρεοειδούς και εκτιμήσαμε τη δυνατότητα χρήσης του αντι-Leu-7 ως διαφοροδιαγνωστικού δείκτου στους όγκους αυτούς.

ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ

Το υλικό της μελέτης απετέλεσαν 73 πρωτοπαθείς όγκοι του θυρεοειδούς και 20 μεταστατικοί, σε διάφορες ανατομικές θέσεις. Τα χειρουργικά παρασκευάσματα, που επιλέχθηκαν από το αρχείο του εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών, είχαν μονιμοποιηθεί σε διάλυμα φορμόλης 10% και είχαν εγκλεισθεί σε κύβους παραφίνης.

Οι πρωτοπαθείς όγκοι περιλάμβαναν 15 θυλακιώδη αδενώματα, 8 θυλακιώδη καρκινώματα, 37 θηλώδη καρκινώματα (18 κλασσικού τύπου, 12 θυλακιώδους τύπου, 7 από υψηλά κύτταρα), πέντε κακοήθεις όγκους από κύτταρα Hurthle, τρία μυελοειδή, ένα νησιδοειδές, και τέσσερα αδιαφοροποίητα καρκινώματα. Τα μεταστατικά καρκινώματα αφορούσαν σε 13 θηλώδη καρκινώματα (σε λεμφαδένες, μαλακά μόρια, πνεύμονα), τρία θυλακιώδη καρκινώματα (σε οστά, εγκέφαλο, πνεύμονα), δύο μυελοειδή καρκινώματα (σε ήπαρ) και δύο αδιαφοροποίητα καρκινώματα (σε λεμφαδένες και μαλακά μόρια).

Οι ιστολογικές τομές, πάχους 5μm, τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρες πλάκες καλυμμένες με ροly-L-Lysine. Εφαρμόσθηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος αβιδίνης-βιοτίνης, όπως έχει περιγραφεί αλλού⁹. Εν συντομία, μετά την αποπαραφίνωση των ιστολογικών τομών και την ενυδάτωσή τους σε προοδευτικώς ελαττούμενες συγκεντρώσεις αιθυλικής αλκοόλης, ακολούθησε η κατανάλωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης, με διάλυμα 0.3% υπεροξειδίου του υδρογόνου σε απόλυτη μεθανόλη, για 30 min. Στη συνέχεια, τα δείγματα επωάσθηκαν με φυσιολογικό ορό αλόγου για 20 min (για να αποφευχθεί η μη-ειδική δέσμευση του πρώτου αντισώματος), και κατόπιν με το μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-Leu-7 του εμπορίου (Becton-Dickinson, San Jose, CΑ) σε αραίωση 1:20, όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία 4^°C. Ακολούθησε η επώαση με βιοτινυλιωμένο αντιορό αλόγου εναντίον IgG ποντικού για 30 min, και στη συνέχεια με το σύμπλεγμα αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (Elit, Vectastain ABC kit, Vector Lαbοratories, Berlingame, CΑ) για 45 min. Τέλος για τη χρωστική αντίδραση χρησιμοποιήθηκε διάλυμα τετραϋδροχλωρικής 3-3' διαμινοβενζιδίνης (Sigma Chemical CO., St Louis, ΜΟ) και Η₂Ο₂, και οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη Mayer.

Οι αραιώσεις των αντισωμάτων έγιναν σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS, ρΗ 7.2. Το ίδιο διάλυμα χρησιμοποιήθηκε και για την έκπλυση των τομών μετά από κάθε επώαση. Όλες οι επωάσεις έγιναν σε υγρό περιβάλλον. Στους αρνητικούς μάρτυρες το πρώτο αντίσωμα αντικαταστάθηκε με TBS. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ιστολογικές τομές από καρκίνωμα προστάτου.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Τα αποτελέσματα ττις μελέτης φαίνονται στον πίνακα 1. Θετική ανοσοαντίδραση παρατηρήθηκε σε 36 από τους 73 (49%) πρωτοπαθείς όγκους του θυρεοειδούς και σε 11 από τους 20 (55%) μεταστατικούς. Από τους θυλακιώδεις όγκους πέντε αδενώματα και δύο καρκινώματα παρουσίασαν μέτριας έντασης ανοσοδραστικότητα στο αντι-Leu-7 αντίσωμα. Η ανοσοχρώση ήταν κυρίως κυτταροπλασματική (Εικ. 1). Σε μία από τις θετικές περιπτώσεις των αδενωμάτων παρατηρήθηκε, επίσης, μέτριας έντασης μεμβρανική χρώση, η οποία εντοπιζόταν σε περιοχές θηλώδους υπερπλασίας.

Εβδομήντα τρία τοις εκατό (27/37) των θηλωδών καρκινωμάτων παρουσίασαν έντονη μεμβρανική ανοσοαντίδραση (Εικ. 2). Σε μερικές από τις περιπτώσεις αυτές αναγνωρίσθηκε, επίσης, ασθενής κυτταροπλασματική χρώση και αφορούσε σε περιοχές με συμπαγή τρόπο ανάπτυξης. Στα κλασσικού τύπου θηλώδη καρκινώματα και σε αυτά από υψηλά κύτταρα η κατανομή και η ένταση της χρώσης ήταν παρόμοια, ενώ στα θυλακιώδους τύπου θηλώδη καρκινώματα η κατανομή του Leu-7 ήταν ανάλογη με αυτή των θυλακιωδών όγκων. Στο 83% των περιπτώσεων (10/12) των θηλωδών καρκινωμάτων θυλακιώδους τύπου δεν παρατηρήθηκε ανοσοαντίδραση στο αντι-Leu-7 αντίσωμα.

Θετική ανοσοαπάντηση στο αντι-Leu-7 παρατηρήθηκε σε ένα από τα τρία μυελοειδή καρκινώματα και στη μοναδική περίπτωση του νησιδοειδούς καρκινώματος. Η αντίδραση ήταν κυτταροπλασματική και έντονη στο μυελοειδές καρκίνωμα, ενώ ήταν λιγότερο έντονη στο νησιδοειδές καρκίνωμα, αλλά πάντως με εμφανή διαγραφή της κυτταρικής μεμβράνης. Οι όγκοι από κύτταρα Hurthle και τα αδιαφοροποίητα καρκινώματα ήταν αρνητικά στην αντι-Leu-7 ανοσοχρωστική αντίδραση. Ο παρακείμενος φυσιολογικός ιστός, σε όλα τα δείγματα που μελετήθηκαν, ήταν αρνητικός ωστόσο, παρατηρήθηκε μια ασθενής χρωστική αντίδραση του κολλοειδούς. Παρόμοια αντίδραση παρουσίαζε, μερικές φορές, και το κολλοειδές των θυλακίων των όγκων.

Ανοσοαντίδραση στο αντι-Leu-7 ανιχνεύθηκε σε εννέα από τα δεκατρία μεταστατικά θηλώδη καρκινώματα και σε δύο από τα τρία θυλακιώδη. Η κατανομή της ανοσοχρώσης ήταν ίδια με αυτή των πρωτοπαθών όγκων. Οι δύο περιπτώσεις μυελοειδούς καρκινώματος, μεταστατικό στο ήπαρ, και οι δύο περιπτώσεις αδιαφοροποίητου καρκινώματος, μεταστατικό σε λεμφαδένες και μαλακά μόρια, ήταν αρνητικές.

Στα δείγματα των θετικών μαρτύρων η ανοσοχρωστική αντίδραση ήταν έντονη και κυτταροπλασματική. Ανοσοχρωστική αντίδραση δεν παρατηρήθηκε στα δείγματα των αρνητικών μαρτύρων.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Το ενδιαφέρον με τους ανοσοϊστοχημικούς δείκτες έγκειται στο γεγονός ότι αποτελούν ένα χρήσιμο “εργαλείο” της παθολογικής ανατομικής, ειδικά για τη διαφορική διάγνωση, πρόγνωση και ταξινόμηση των όγκων. Η ταξινόμηση των όγκων του θυρεοειδούς βασίζεται κυρίως στην αξιολόγηση των ιστοπαθολογικών χαρακτηριστικών τους. Η μορφολογική εκτίμηση, όμως, δεν καθορίζει πάντα και τη βιολογική συμπεριφορά ενός όγκου. Για παράδειγμα, ο διαχωρισμός μεταξύ θυλακιώδους αδενώματος και καλά διαφοροποιημένου θυλακιώδους καρκινώματος, ως γνωστόν, είναι δυνατός μόνο σε εκείνες τις περιπτώσεις που υπάρχει διήθηση της κάψας ή/και των αγγείων, ή μετάσταση. Μέχρι στιγμής, η ανοσοϊστοχημεία ενώ μπορεί να προσδιορίσει την κυτταρική προέλευση των όγκων του θυρεοειδούς¹⁰, ελάχιστα μπορεί να βοηθήσει στην ταξινόμησή τους¹¹. Μια πρόσφατη μελέτη θεωρεί ότι η χρήση του αντι-Leu-7 αντισώματος αποτελεί έναν επιπρόσθετο αξιόλογο δείκτη στη διαφορική διάγνωση μεταξύ καλοήθων και κακοήθων, θυλακιωδών και θηλωδών, βλαβών του θυρεοειδούς, και ότι θα πρέπει να χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλους ανοσοϊστοχημικούς δείκτες, ως συμπλήρωμα της μορφολογικής διάγνωσης⁸.

Στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε αυτή την υπόθεση, ελέγχοντας, ανοσοϊστοχημικώς, μια σειρά από διαφόρου βαθμού διαφοροποίησης, πρωτοπαθή και μεταστατικά καρκινώματα του θυρεοειδούς. Οι όγκοι που επεξεργάζονταν θηλώδη μορφολογία, όπως τα θηλώδη καρκινώματα κλασσικού τύπου, τα τύπου από υψηλά κύτταρα και τα αντίστοιχα μεταστατικά καρκινώματα, έδωσαν μια έντονη μεμβρανική ανοσοχρώση στο αντι-Leu-7 αντίσωμα. Τα ευρήματά μας, όσον αφορά στα θηλώδη καρκινώματα, συμφωνούν με αυτά των Ghali et al⁸. Ωστόσο, μόνο το 25% των θυλακιωδών καρκινωμάτων, το 33% των θυλακιωδών αδενωμάτων, και το 17% των θηλωδών καρκινωμάτων, θυλακιώδους τύπου, παρουσίασαν Leu-7 ανοσοδραστικότητα. Οι όγκοι αυτοί χαρακτηρίζονταν από ένα θυλακιώδη τρόπο ανάπτυξης και η κατανομή της χρώσης ήταν κυτταροπλασματική. Σε αντίθεση με τις μεταστάσεις του θηλώδους καρκινώματος, η ένταση και η κατανομή της χρώσης, στις μεταστάσεις του θυλακιώδους καρκινώματος, δεν έμοιαζε με αυτήν του πρωτοπαθούς όγκου. Σε λίγα μόνο κύτταρα των μεταστατικών όγκων παρατηρήθηκε Leu-7 ανοσοαντίδραση.

Από τα τρία πρωτοπαθή μυελοειδή καρκινώματα, που μελετήσαμε, ένα εμφάνισε έντονη κυτταροπλασματική αντίδραση στο αντι-Leu-7 αντίσωμα, ενώ στα άλλα δύο, καθώς και στις δύο περιπτώσεις μεταστατικού όγκου η απουσία ανοσοαντίδρασης ήταν πλήρης. Το εύρημα αυτό ήταν μη αναμενόμενο, δεδομένου ότι το μυελοειδές καρκίνωμα του θυρεοειδούς θεωρείται ότι ανήκει στα νευροενδοκρινή νεοπλάσματα, όπου το αντιγόνο Leu-7 συνήθως εκφράζεται. Ωστόσο, η παρατήρηση αυτή συμφωνεί με ανάλογα ευρήματα προηγούμενων ερευνών⁸. ΆΑλλοι όγκοι νευροεξωδερμικής προέλευσης, στους οποίους επίσης δεν έχει ανιχνευθεί ανοσοδραστικότητα στο Leu-7, είναι το νευροβλάστωμα και το κακόηθες μελάνωμα^3,4,12. Το εύρημα αυτό θα μπορούσε να θεωρηθεί ως ένδειξη της ετερογένειας των όγκων αυτών. Για να καταλήξουμε, όμως, σε ένα σαφές συμπέρασμα θα πρέπει να μελετηθεί μεγαλύτερος αριθμός περιπτώσεων.

Τα τέσσερα πρωτοπαθή και τα δύο μεταστατικά αδιαφοροποίητα καρκινώματα δεν έδειξαν καμία ανοσοδραστικότητα στο αντι-Leu-7 αντίσωμα. Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι η διαφοροποίηση ενός όγκου παίζει καθοριστικό ρόλο στην έκφραση του Leu-7 αντιγόνου. Ωστόσο, η μια περίπτωση νησιδοειδούς καρκινώματος της μελέτης, που ως γνωστό αντιπροσωπεύει ένα χαμηλής διαφοροποίησης καρκίνωμα¹³ ή αποδιαφοροποίηση ενός καλά διαφοροποιημένου καρκινώματος του θυρεοειδούς¹⁴, ήταν έντονα θετική για Leu-7 αντιγόνο.

Τα αποτελέσματα της μελέτης μας έδειξαν ότι το Leu-7 αντιγόνο εκφράζεται μεμβρανικά στα νεοπλάσματα του θυρεοειδούς αδένος με θηλώδη μορφολογία. αλλά η ανίχνευσή του δεν συμβάλλει στη διαφορική διάγνωση μεταξύ καλοήθων και κακοήθων νεοπλασμάτων με θυλακιώδη ή συμπαγή τρόπο ανάπτυξης.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Οι συγγραφείς επιθυμούν να εκφράσουν τις ευχαριστίες τους στις παρασκευάστριες Ρ. Ρασσιά και Γ. Γκότση, για την τεχνική προετοιμασία των δειγμάτων.

Bιβλιογραφια