ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Οι αδενωματώδεις πολύποδες του παχέος εντέρου είναι γνωστό ότι υφίστανται καρκινωματώδη εξαλλαγή σε ένα μικρό σχετικά ποσοστό που δεν ξεπερνά το 10% των περιπτώσεων. Πάντως σήμερα πιστεύεται ότι το μεγαλύτερο ποσοστό των αδενοκαρκινωμάτων του παχέος εντέρου αναπτύσσονται σε έδαφος προϋπαρχόντων πολυπόδων. Μελέτες και σε άλλες προκαρκινικές αλλοιώσεις όπως περιπτώσεις χρονίας ελκώδους κολίτιδας με υψηλού βαθμού επιθηλιακή δυσπλασία έδειξαν ότι η ανευπλοειδία του DNA των επιθηλιακών κυττάρων μπορεί να συνδέεται με κακοήθη εξαλλαγή και επομένως μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένας αξιόπιστος δείκτης δυνητικής βιολογικής επιθετικότητας^1,2. Ανευπλοειδία δεν διαπιστώθηκε σε περιπτώσεις νόσου του Crohn³. Γενικά, τα πρότυπα κατανομών του DNA δίνουν πληροφορίες για την πλοειδικότητα και -μέσω του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στη S-φάση του κυτταρικού κύκλου- για την τάση πολλαπλασιασμού ενός επιθετικού κυτταρικού πληθυσμού. Ο κυτταρικός αναδιπλασιασμός μπορεί επίσης να εκτιμηθεί ανοσοϊστοχημικά με την έκφραση του πυρηνικού αντιγόνου πολλαπλασιαζομένων κυττάρων PCNA στα νεοπλασματικά επιθήλια⁴.

Το PCNA αφορά μια πυρηνική πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 36 kD η οποία σχετίζεται στενά με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και ανακαλύφθηκε ανεξάρτητα από τους Miyachi (1978) και Bravo (1980). Με νεότερα δεδομένα υποστηρίζεται ότι το PCNA είναι ένα βοηθητικό μόριο για την DNA-πολυμεράση-δ⁵. Το ένζυμο αυτό σχετίζεται με την επιμήκυνση της "οδηγού" αλυσίδας κατά την αντιγραφή του DNA - μια διαδικασία με υψηλές ενεργειακές απαιτήσεις στην οποία το PCNA παίζει έναν πρωταρχικό ρόλο δρώντας ως ΑΤΡάση. Έτσι, το PCNA ανιχνεύεται στον πυρήνα ταχέως πολλαπλασιαζομένων κυττάρων, συχνά όταν αυτά βρίσκονται στην S-φάση του κυτταρικού κύκλου τους. Η σημασία του PCNA γίνεται πιο εμφανής από το γεγονός ότι αυτό είναι φυλογενετικά σταθερά διατηρημένο κι ανιχνεύεται σε φυτά κι ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς⁶. Η ανίχνευση του PCNA είναι χρήσιμη στην προγνωστική μελέτη ενός αριθμού νεοπλασματικών, αλλά κυρίως προκαρκινικών αλλοιώσεων, σε ό,τι αφορά την εκτίμηση της κυτταροκινητικής συγκριτικά με την υπερπλασία και τη δυσπλασία του επιθηλίου.

Στην παρούσα μελέτη αναζητείται μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ της ανευπλοειδίας του DNA και της αυξημένης PCNA έκφρασης σε 68 αδενώματα παχέος εντέρου και προσπαθούμε να συσχετίσουμε τις παραμέτρους αυτές με τα τρέχοντα επιβαρυντικά προγνωστικά κριτήρια για τα αδενώματα του παχέος εντέρου ήτοι τη σοβαρού βαθμού δυσπλασία, το θηλώδη ιστολογικό τύπο και το μεγάλο μέγεθος των αδενωμάτων (> 2 εκ.).

ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ

Μελετήσαμε αναδρομικά από κύβους παραφίνης 68 περιπτώσεις αδενωμάτων παχέος εντέρου από τα οποία τα 8 παρουσίαζαν περιοχές με χαρακτήρες καρκινωματώδους εξαλλαγής. Οι περιπτώσεις αφορούσαν 41 άνδρες και 27 γυναίκες με διάμεση ηλικία τα 63 έτη. Η διάμετρος των πολυπόδων κυμαινόταν από 1,2 έως 3,8 εκ. Τα 60 καλοήθη νεοπλάσματα που μελετήθηκαν ταξινομήθηκαν ιστολογικά σε σωληνώδη, σωληνολαχνωτά και θηλώδη (Πίνακας 1) και προσδιορίσθηκε η επιθηλιακή δυσπλασία είτε ως ελαφρά είτε ως ενδιάμεση έως έντονη⁷.

Προκειμένου να μελετηθεί η συχνότητα και η κατανομή των ανευπλοειδικών πληθυσμών, ελήφθησαν από κάθε περίπτωση τουλάχιστον δύο τομές παραφίνης πάχους 50 μm για ανάλυση DNA και άλλες δύο τομές πάχους 3 μm για ιστολογική και ανοσοϊστοχημική εκτίμηση.

Η κυτταρομετρική τεχνική μας ήταν παρόμοια με αυτή που προτάθηκε από τον Hedley et al⁸. Συνοπτικά,μία ή δύο τομές από κάθε κύβο πάχους 50 μm αποπαραφινώθηκαν σε ξυλόλη κι ενυδατώθηκαν σε κατιούσες συγκεντρώσεις διαλυμάτων αιθανόλης. Κατόπιν ξεπλύματος και κατακερματισμού οι ιστοί επωάσθηκαν σε διάλυμα πεψίνης 0,5% (Sigma Chemical Company) στους 37^o C και σε pH 1,5 για 30 λεπτά. Τα δείγματα αναρροφήθηκαν επανειλημμένα μέσω μιας πιπέττας Pasteur και φιλτραρίστηκαν μέσω ενός δικτύου 37 μm ώστε να προκύψουν αιωρήματα μεμονωμένων κυτταρικών πυρήνων. Οι εν λόγω πυρήνες χρώσθηκαν σε διάλυμα βρωμιούχου άλατος 2,5x10-5 M σε ουδέτερο Tris EDTA με υψηλή κατ' όγκο μοριακότητα (385 mOsm). Το περιεχόμενο των πυρήνων σε DNA αναλύθηκε με ταχείας ροής κυτταρομετρητή ICP11 (ρυθμός ροής έως 10.000 κύτταρα ανά δευτερόλεπτο). Τα μήκη κύματος ερεθισμού και εκπομπής κυμαίνονταν στα 455-490 nm και στα 590-630 nm αντίστοιχα. Η απόδοση εκτιμήθηκε με αναλυτή πολλαπλών διαύλων. Οι αναλογίες των κυττάρων κάθε φάσης του κύκλου κυτταρικής διαίρεσης καθορίσθηκαν από το συνολικό αριθμό κυττάρων και τα αντιστοιχούντα τμήματα του κάθε ιστογράμματος DNA. Το ποσό του κυτταρικού DNA του κυρίαρχου κυτταρικού πληθυσμού εκφράστηκε ως δείκτης DI (DI=ένταση φθορισμού της κορυφής του αδενώματος/ένταση φθορισμού της κορυφής των κυττάρων-μαρτύρων). Ως ένα πρώτο βήμα, τα κύτταρα με φυσιολογική ποσότητα DNA (διπλοειδικού τύπου) και άρα φυσιολογική κατανομή φθορισμού του DNA ταυτοποιήθηκαν σε σχέση με διπλοειδικό λεμφοκυτταρικό πληθυσμό από σπλήνα ποντικού ο οποίος χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας διπλοειδικότητας. Μετά από καθορισμό της θέσης του διπλοειδικού DNA, τυχόν επιπλέον (ανευπλοειδικό) ποσό γενετικού υλικού υπολογίστηκε ως ο λόγος μεταξύ οποιασδήποτε συμπληρωματικής ανευπλοειδικής κορυφής και της διπλοειδικής. Συγκεκριμένα, ως διπλοειδικά (D), θεωρήθηκαν τα νεοπλάσματα στα οποία ποσοστό κυττάρων άνω του 70% διέθετε τιμή DI στο εύρος ανάμεσα στο 0,8 και στο 1,12. Τα νεοπλάσματα με ποσοστό κυττάρων ίσο ή μεγαλύτερο του 10% να επιδεικνύει τιμή DI εκτός των ορίων 0,8 έως 1,8 θεωρήθηκαν ανευπλοειδικά (ΑΝ). Ανευπλοειδικά όμως θεωρήθηκαν και εκείνα τα δείγματα με ποσοστό κυττάρων ίσο ή μεγαλύτερο του 20% να διαθέτει DI στο εύρος 1,12 έως 1,8. Ειδικότερα, τα νεοπλάσματα με ποσοστό κυττάρων ίσο ή μεγαλύτερο του 5% να έχει DI στην περιοχή από 2,12 έως 4,12 θεωρήθηκαν τετραπλοειδικά δηλαδή με ποσότητα DNA διπλάσια του φυσιολογικού κι ενσωματώθηκαν στα ανευπλοειδικά. Τα κυτταρομετρικά αποτελέσματα αξιολογήθηκαν χωρίς να είναι γνωστά τα μορφολογικά και ανοσοϊστοχημικά ευρήματα. Στις περιπτώσεις διπλοειδίας χωρίς πολλά ξένα συντρίμματα από τα κύτταρα του στρώματος των όγκων (22/36) το ποσοστό επιθηλιακών κυττάρων στη φάση-S (δηλαδή στη φάση σύνθεσης του DNA) του κυτταρικού κύκλου υπολογίστηκε ως ένα επιπλέον δείκτης πολλαπλασιασμού με μαθηματική ανάλυση των ιστογραμμάτων, από την παρυφή της G1/S φάσης (σχετική ένταση φθορισμού περιοχής 2C) έως την παρυφή της S/G2 φάσης (σχετική ένταση φθορισμού περιοχής 4C) (Eικ. 1).

Μελετήθηκε ανοσοϊστοχημικά η έκφραση του PCNA τόσο στο νεοπλασματικό ιστό όσο και στον παρακείμενο εντερικό βλεννογόνο. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα PC-10 (Dako) σε αραίωση 1:200 με ολυνύχτια επώαση με τεχνική ανοσοϋπεροξειδάσης τριών σταδίων σε συνδυασμό με αβιδίνη-βιοτίνη (ABC). Σε κάθε ιστολογική τομή προσδιορίσθηκε το PC-10 score, δηλαδή το μέσο ποσοστό PCNA θετικών πυρήνων επί του συνόλου των επιθηλιακών κυττάρων κάθε αδενώματος μετά από μελέτη 10 τουλάχιστον οπτικών πεδίων μεγάλης μεγέθυνσης (HPF)(X400).

Όλα τα εξαγόμενα αποτελέσματα εξετάσθηκαν για τυχόν στατιστικές συσχετίσεις μεταξύ τους καθώς και με τις άλλες διαθέσιμες παραμέτρους με τη δοκιμασία x² κατόπιν διορθώσεως κατά Yates.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Όλα τα προκύψαντα ιστογράμματα υποδιαιρέθηκαν σε τρεις τύπους:

- Τύποι Ι και ΙΙ: Διπλοειδικά αδενώματα (n=36). Ειδικότερα:

- Τύπος Ι: Διπλοειδικό αδένωμα (DI~1) με ποσοστό επιθηλιακών κυττάρων στη S φάση < 10% (n=12) (Εικ. 1).

- Τύπος ΙΙ: Διπλοειδικό αδένωμα (DI~1) με ποσοστό επιθηλιακών κυττάρων στη S φάση > =10% (n=10).

- Τύπος ΙΙΙ: Ανευπλοειδικό αδένωμα (n=32) (Εικ. 2).

Από τους 60 μη εξαλλαγέντες πολύποδες που εξετάσθηκαν με κυτταρομετρία ροής, οι 27 εμφάνισαν DNA ανευπλοειδία. Όπως δείχνει ο πίνακας 2, η ανευπλοειδία του DNA συσχετίσθηκε με το ιστολογικό εύρημα της ελαφράς δυσπλασίας σε 12 από τις 39 περιπτώσεις (30,67%) και της εντονότερης δυσπλασίας σε 15 από τις 21 (71,4%) (δύο από τις οποίες με διπλούς ανευπλοειδικούς πληθυσμούς DI=1,7/1,9 και 1,3/1,8 αντίστοιχα) (p<0,05). Πέντε από τους 8 (62,5%) πολύποδες με χαρακτήρες καρκινωματώδους εξαλλαγής (στους οποίους είχε διασπαστεί η βλεννογόνια μυϊκή στιβάδα) ήταν ανευπλοειδικοί με DΙ από 1,4 έως 2,8. Οι υπόλοιπες 36 περιπτώσεις (33 καλοήθεις πολύποδες και 3 με κακοήθη εξαλλαγή) εμφάνισαν διπλοειδία του DNA. Ειδικά στις 33 καλοήθεις διπλοειδικές περιπτώσεις παρατηρήθηκε μια αυξημένη PCNA θετική έκφραση στα αδενώματα με σοβαρή δυσπλασία σε σύγκριση με εκείνα με ήπια δυσπλασία. Όμως δεν παρατηρήθηκε μια τέτοια διαφορά στα 7 θηλώδη αδενώματα της έρευνάς μας. Εδώ πρέπει να σημειώσουμε ότι στα δείγματά μας δεν αναδείχθηκε κάποια εμφανής συσχέτιση μεταξύ του ιστολογικού τύπου και της πλοειδικότητας του DNA ή της έκφρασης του PCNA.

Το ποσοστό των ανευπλοειδικών αδενωμάτων της μελέτης μας με ελαφρά δυσπλασία είναι μεγαλύτερο από αντίστοιχα ποσοστά άλλων εργασιών π.χ. 18%, σε σωληνώδους όμως τύπου αδενώματα⁹. Έτσι, ο ιστολογικός τύπος ενός πολύποδα (ιδίως ο θηλώδης) δεν αποκλείεται να συνδέεται με την ανίχνευση ανευπλοειδικού DNA¹⁰ χρειάζεται όμως διερεύνηση μεγαλύτερου δείγματος.

Στα 22 νεοπλάσματα όπου κατέστη εφικτός ο προσδιορισμός του ποσοστού των κυττάρων της S φάσης, τα ποσοστά θετικότητας του PC-10 ήταν γενικά υψηλότερα, αλλά η διακύμανση των τιμών τους ακολουθούσε ευθέως ανάλογα εκείνη των ποσοστών της S-φάσης. Τα γενικώς αυξημένα ποσοστά PC-10 θετικών νεοπλασματικών κυττάρων (συγκριτικά με τα αντίστοιχα της S-φάσης) μπορούν να δικαιολογηθούν από την πιθανή επίδραση ορισμένων αυξητικών παραγόντων (π.χ. PDGF, FGF) που μπορούν να αυξήσουν τη σταθερότητα του mRNA του PCNA και να επηρεάσουν έτσι την έκφραση του PCNA, χωρίς απαραιτήτως να επάγεται η σύνθεση του DNA¹¹. Επί πλέον πρέπει να αναφέρουμε ότι τα ποσοστά των κυττάρων της φάσης S (ιστογράμματα τύπου Ι και ΙΙ) δεν φάνηκαν να σχετίζονται με το βαθμό επιθηλιακής δυσπλασίας των 22 πολυπόδων.

Όλα τα αδενώματα έδειξαν γενικά μια αύξηση στον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών τους κυττάρων (μεγαλύτερη PCNA έκφραση) συγκρινόμενα με το φυσιολογικό παρακείμενο βλεννογόνο, όποτε αυτός μπορούσε να παρατηρηθεί. Υπήρχε επίσης τάση θετικής συσχέτισης μεταξύ του μεγέθους των διπλοειδικών αδενωμάτων και της έκφρασης PCNA.

Η χρώση με PC-10 στο φυσιολογικό ή ελαφρά υπερπλαστικό, παρακείμενο των αδενωμάτων, βλεννογόνο περιορίστηκε στο μέσο και κατώτερο τριτημόριο των κρυπτών. Στα αδενώματα παρατηρήθηκε μια ανομοιογενής έκφραση του PCNA, καθώς οι PCNA θετικοί πυρήνες ήταν διάσπαρτοι σε όλη την έκταση του πολύποδα από τις επιφανειακές έως τις βαθύτερες περιοχές. Γενικά, στα αδενώματα με ήπια επιθηλιακή δυσπλασία οι PCNA θετικοί πυρήνες αφορούσαν τα κύτταρα με πυρήνες διατεταγμένους εγγύς της βασικής μεμβράνης των σωληνωδών σχηματισμών, ενώ στα αδενώματα με υψηλού βαθμού επιθηλιακή δυσπλασία οι PCNA θετικοί πυρήνες διακρίνονταν σε όλους τους στοίχους των κυττάρων που συμμετείχαν.

Ο αριθμός των PCNA θετικών πυρήνων σε σχέση με τον αριθμό του συνόλου των επιθηλιακών κυττάρων που προσδιορίζεται από το μέσο PC-10 score, ανερχόταν στο 38% (με αξιοσημείωτο εύρος διακύμανσης μεταξύ των περιπτώσεων από 10 έως και 80%). Το μέσο PC-10 score δεν παρουσίαζε σχέση με το βαθμό επιθηλιακής δυσπλασίας των πολυπόδων που μελετήθηκαν (Πίνακας 3). Η αντίστοιχη μέση τιμή για τα 8 αδενώματα που είχαν εξαλλαγεί σε διηθητικά καρκινώματα ήταν 57% και μάλιστα στις δυσπλαστικές περιοχές των 5 αδενωμάτων παρατηρήθηκαν τα μεγαλύτερα PC-10 ποσοστά (της τάξης του 80%) (Εικ. 3).

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η μελέτη της κυτταρικής κινητικής μέσω του πυρηνικού αντιγόνου πολλαπλασιαζομένων κυττάρων και της πλοειδικότητας του DNA μπορεί να μας διαφωτίσει σχετικά με τη βιολογική συμπεριφορά των αδενωμάτων του παχέος εντέρου, γεγονός που θα μας επιτρέψει εμμέσως να εκτιμήσουμε και τη δυνατότητα εξαλλαγής τους σε καρκινώματα^4,12,13.

Η παρουσία μη φυσιολογικής ποσότητας DNA στα νεοπλασματικά κύτταρα (DNA ανευπλοειδία) ήταν συχνότερη σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (p<0,05), όσο αύξανε ο βαθμός επιθηλιακής δυσπλασίας (Πίνακας 2). Από την άλλη πλευρά, στις περιπτώσεις με κυρίως φυσιολογική ποσότητα DNA στα κύτταρα των αδενωμάτων (ευπλοειδικά) η έντονη δυσπλασία και η κακοήθης εξαλλαγή συσχετίσθηκε με αυξημένη PCNA έκφραση (Πίνακας 3). Πάντως, το αξιόλογο εύρος διακύμανσης των PCNA θετικών επιθηλιακών κυττάρων επιβάλλει τη συσχέτιση του δείκτη αυτού με άλλες παραμέτρους τεκμηριωμένης προγνωστικής αξίας. Έτσι, εάν ένα αδένωμα με ελαφρά δυσπλασία χαρακτηρίζεται από ικανό κυτταρικό αναδιπλασιασμό το εύρημα αυτό από μόνο του δεν προδικάζει πιθανή κακοήθη εξαλλαγή.

Η παρατήρησή μας ότι όλα τα αδενώματα της μελέτης που είχαν υποστεί κακοήθη εξαλλαγή (επεκτεινόμενα διηθητικά πέρα από τη βλεννογόνια μυϊκή στιβάδα), είχαν τα μεγαλύτερα ποσοστά PCNA θετικών επιθηλιακών κυττάρων στις δυσπλαστικές τους εστίες μπορεί να έχει κάποια κλινική σημασία. Συγκεκριμένα, οι βιοψίες από πολύποδες που έχουν τόσο μεγάλο ποσοστό PCNA έκφρασης στις αδενωματώδεις δυσπλαστικές περιοχές τους μπορεί να εγείρουν υπόνοιες ύπαρξης καρκινωματώδους εξαλλαγής σε παρακείμενη περιοχή. Βιβλιογραφικώς, έχει πρόσφατα υποστηριχθεί και η άποψη ότι η ανίχνευση ανευπλοειδίας του DNA σε αδενωματώδεις περιοχές νεοπλασμάτων μπορεί να προσδιορίζει αρχόμενη κακοήθη εξαλλαγή¹⁴.

Συμπερασματικά, εκτός από τους κλασικούς επιβαρυντικούς παράγοντες που αφορούν την παρακολούθηση των ασθενών με πολύποδες παχέος εντέρου (μέγεθος < 2 εκ., λαχνωτός ιστολογικός τύπος και σοβαρός βαθμός δυσπλασίας) χρήσιμο θα ήταν να λαμβάνονται συμπληρωματικά υπόψη η πλοειδικότητα του DNA και η ανοσοϊστοχημική έκφραση του PCNA, επιβάλλεται ωστόσο μελέτη μεγαλύτερου βαθμού περιπτώσεων για πληρέστερη στατιστική ανάλυση τυχόν συσχετίσεων μεταξύ των εξετασθέντων δεικτών.

Βιβλιογραφία