ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Πρόοδοι σε διάφορα πεδία έρευνας έχουν πρόσφατα συμβάλει στην κατανόηση της συχνά απρόβλεπτης πορείας των κακοήθων μελανωμάτων. Η γονιδιακή αστάθεια καθώς και οι επερχόμενες αλλαγές στην προσκόλληση των κακοήθων κυττάρων με τα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας¹ εμπλέκονται στην εξάπλωση των όγκων² και ίσως συνιστούν τα πρώιμα χαρακτηριστικά που προσδιορίζουν την επιθετικότητα ως προς τη δυνατότητα χορήγησης μεταστάσεων³, δοθέντος ότι τα νεοπλασματικά κύτταρα αλληλεπιδρούν διαφορετικά με την περιβάλλουσα εξωκυττάρια ουσία απ' ό,τι τα φυσιολογικά αντίστοιχά τους⁴.

Η βασική μεμβράνη είναι μία σύνθετη εξωκυττάρια ουσία αποτελούμενη από ινονεκτίνη και άλλες γλυκοπρωτεΐνες, οι οποίες παράγονται από μία ευρεία ποικιλία κυττάρων και εμπλέκονται ενεργά στις αλληλεπιδράσεις της κυτταρικής ουσίας με ειδικούς κυτταρικούς υποδοχείς που ρυθμίζουν την προσκόλληση των κυττάρων του όγκου στο υπόστρωμα των βασικών μεμβρανών (το πρώτο βήμα διείσδυσης των κακοήθων κυττάρων και αποικοδόμησης του φραγμού της βασικής μεμβράνης⁵). 'Ενας τύπος ινονεκτίνης υπάρχει σε διαλυτή μορφή στο αίμα ή σε άλλα σωματικά υγρά, ενώ μία άλλη αδιάλυτη μορφή εντοπίζεται στην επιφάνεια των κυττάρων, στα εξωκυττάρια διαστήματα του συνδετικού ιστού και ως συστατικό των βασικών μεμβρανών σε όλο το πάχος τους σε ορισμένα σημεία του σώματος. Οι κύριες βιολογικές λειτουργίες της ινονεκτίνης συμπεριλαμβάνουν τη συσσωμάτωση κυττάρου με κύτταρο, την προσκόλληση κυττάρων στο υπόστρωμα, την αύξηση της κυτταρικής κινητικότητας και τη σύνδεση με ορισμένα μακρομόρια. Στο φυσιολογικό δέρμα μια μεγάλη ποσότητα ινονεκτίνης είναι παρούσα σε περιοχές όπου συμβαίνει κυτταρική διαίρεση⁶, σε επαφή με εξωκυττάριες δομές στο χόριο, στα τοιχώματα των αιμοφόρων αγγείων και τριχοειδών, σε τμήματα συνδετικού ιστού και ειδικά στην ένωση χορίου-επιδερμίδας. Σε άρρωστο ή τραυματισμένο δέρμα η ινονεκτίνη τείνει να εμφανίζεται σε ανώμαλα αυξημένες ποσότητες μόνο στις προσβεβλημένες περιοχές και μάλιστα όπου συμβαίνει κυτταρικός πολλαπλασιασμός.

Η εκτίμηση του κλάσματος κυτταρικού πολλαπλασιασμού είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του κακοήθους φαινοτύπου, καθώς το κλάσμα αυτό συσχετίζεται με το βαθμό κακοηθείας διαφόρων νεοπλασμάτων και μπορεί να δώσει πολύτιμες πληροφορίες που αφορούν την κυτταρική κινητική αύξησης, την ανάπτυξη του όγκου -συμπεριλαμβανομένου του μεταστατικού δυναμικού του- και γενικά την πρόγνωση⁸. Η κυτταρική κινητική αύξησης φυσιολογικών όσο και νεοπλασματικών ανθρώπινων ιστών έχει μελετηθεί χρησιμοποιώντας διάφορες τεχνικές⁹, μεταξύ των οποίων είναι και η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση αντιγόνων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο.

Το πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζομένων κυττάρων (PCNA) είναι μία πυρηνική πρωτεΐνη 36 Kd η οποία συνδέεται στενά με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, σαν βοηθητικό μόριο για τη DNA-πολυμεράση-δ. Αυτό το ένζυμο έχει σχέση με την αντιγραφή του DNA, μια διαδικασία με υψηλές ενεργειακές ανάγκες στην οποία το PCNA παίζει ένα ρόλο-κλειδί λειτουργώντας ως ΑΤΡάση¹⁰. 'Ετσι, το PCNA ανιχνεύεται στον πυρήνα ταχέως πολλαπλασιαζομένων κυττάρων κατά τη διάρκεια του τέλους της G1 και κατά την S φάση του κύκλου της διαίρεσης και χρησιμεύει ως δείκτης πολλαπλασιασμού¹¹, έστω και εμμέσως λόγω μακρού χρόνου ημιζωής.

Αν και καθένας από τους προαναφερθέντες δείκτες έχει ξεχωριστά μελετηθεί στο παρελθόν, ο σκοπός αυτής της έρευνας είναι να ανακαλύψει εάν υπάρχει σχέση μεταξύ της συνέχειας της ινονεκτίνης, της έκφρασης του PCNA και αρκετών κλινικοϊστοπαθολογικών προγνωστικών παραμέτρων σε μια εμπεριστατωμένη μελέτη 48 πρωτοπαθών μελανωμάτων.

ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Εξετάστηκαν ιστικές τομές από 48 κακοήθη μελανώματα δέρματος. Η μέση ηλικία των ασθενών μας ήταν 43,72 έτη (26-70 ετών, διάμεση ηλικία: 45 έτη) και η αναλογία ανδρών-γυναικών ήταν 31:17 (1,82). 'Ολα τα κακοήθη μελανώματα ταξινομήθηκαν ανάλογα με το φύλο, την ηλικία, την ανατομική εντόπιση [κεφαλή (n=4), κορμός (n=11), άκρα (n=31), άκρες χείρες και πόδες (n=2)], τον κλινικο-ιστοπαθολογικό τύπο (14 οζώδη, 30 επιφανειακώς επεκτεινόμενα, 2 κακοήθεις εφηλίδες, 2 του τύπου των κακοήθων εφηλίδων άκρων), τον τύπο των κακοήθων μελανοκυττάρων (19 επιθηλιοειδή, 15 ατρακτοειδή, 8 μικτά, 6 άλλοι τύποι), τη φάση ανάπτυξης του όγκου (14 χωρίς επίπεδη φάση ανάπτυξης, 34 με επίπεδη μεταπίπτουσα σε κάθετη ή όχι), το μιτωτικό δείκτη σύμφωνα με το σύστημα του McGovern¹² (απούσα σε 4, χαμηλή σε 29 και υψηλή μιτωτική δραστηριότητα σε 15 από τις περιπτώσεις μας) και το επίπεδο διήθησης κατά Clark¹³ (5 ήταν σε επίπεδο Clark Ι, 12 Clark ΙΙ, 15 Clark ΙΙΙ, 10 Clark IV, 6 Clark V). Να προσθέσουμε εδώ ότι χρησιμοποιήσαμε πολωμένο φως, έτσι ώστε να διαχωρίσουμε τα Clark IV από τα Clark III επίπεδα διήθησης.

Επιπλέον όλα τα νεοπλάσματα ταξινομήθηκαν σύμφωνα με το πάχος τους κατά Breslow¹⁴ (14 περιπτώσεις με Breslow <0,75 mm, 12 μεταξύ 0,75-1,5 mm, 15 με 1,6-4 mm και 7 με >4 mm), την παρουσία μελανίνης, την ύπαρξη και το βαθμό της φλεγμονώδους απάντησης του ξενιστή οργανισμού¹⁵ [απούσα ή ήπια (n=40), μέτρια ή ικανή λεμφοκυτταρική διήθηση (n=8)], την παρουσία μερικής ή ολικής ανοσολογικής υποστροφής¹⁶, την παρουσία εξέλκωσης (αρχόμενη σε 5 περιπτώσεις, εμφανή σε 24 περιπτώσεις), την αγγειακή διήθηση (παρούσα σε 9 δείγματα), την παρουσία μικροσκοπικών δορυφόρων εστιών¹⁵ (σε 15 περιπτώσεις), τη φύση της κατώτερης παρυφής του όγκου (απωστική στα 28 δείγματα, διηθητική σε 20) και το κλινικό στάδιο της νόσου¹⁷ [27 σε στάδιο Ι (νόσος περιοριζόμενη σε τοπικό επίπεδο), 15 σε στάδιο ΙΙ (επιχώριοι λεμφαδένες διηθημένοι), 6 σε στάδιο ΙΙΙ (παρουσία απομεμακρυσμένων μεταστάσεων)].

Ανοσοϊστοχημεία της ινονεκτίνης και του PCNA

H χρωστική τεχνική της ανοσοϋπεροξειδάσης 3 σταδίων σε συνδυασμό με αβιδίνη-βιοτίνη χρησιμοποιήθηκε σε ιστικές τομές παραφίνης πάχους 4 μm. Μετά τη σταδιακή αποπαραφίνωση, η δραστηριότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης διακόπηκε με την επώαση των πλακιδίων με 0,1% υπεροξείδιο του υδρογόνου σε διάλυμα μεθανόλης για 20 λεπτά. Προετοιμασία των πλακιδίων σε διάλυμα πρωτεάσης τύπου XXIV (sigma, P-8038) 0,04% για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου κρίθηκε απαραίτητη ώστε να βελτιωθούν τα αποτελέσματα της χρώσης της ινονεκτίνης.

Σαν κύρια αντισώματα χρησιμοποιήσαμε το Α-245 Ab έναντι της ινονεκτίνης (DAKO) σε διάλυση 1:200 με ολονύχτια επώαση στους 4οC και το μονοκλωνικό αντι-PCNA Ab από ποντικό (κλώνος PC-10, DAKO) σε διάλυμα 1:250 με επώαση 24 ωρών. Η αμινο-αιθυλοκαρβαζόλη χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο και οι τομές στο τέλος πέρασαν κι από αιματοξυλίνη Mayer. Τμήματα του όγκου που υποβλήθηκαν στην όλη διαδικασία εκτός από την επώαση με τα κύρια αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως εναλλακτικοί μάρτυρες. Ως αρνητικούς μάρτυρες για τη χρώση της ινονεκτίνης χρησιμοποιήσαμε ιστικά τεμάχια στοματικού βλεννογόνου με αλλοιώσεις δισκοειδούς ερυθηματώδους λύκου καθώς αυτή είναι η μόνη ασθένεια κατά την οποία η επιφάνεια του επιθηλίου χαρακτηρίζεται από ολοκληρωτική έλλειψη ινονεκτίνης⁶. Η ανεύρεση της τελευταίας στις υποενδοθηλιακές βασικές μεμβράνες των αιμοφόρων αγγείων που ήταν παρόντα στις τομές μας χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός θετικός μάρτυρας. Τομές από αμυγδαλικό λεμφικό ιστό χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες για το PCNA λόγω της εμφανούς ανίχνευσης του δείκτη αυτού στα βλαστικά κέντρα. Επιπλέον, καθώς πολλοί παράγοντες στην προετοιμασία των τομών επηρεάζουν την ευαισθησία της χρώσης με το έναντι του ΡCNA αντίσωμα, επιβεβαιώσαμε σ' όλες τις περιπτώσεις ότι κάποια από τα κύτταρα της μαλπιγιακής στιβάδας της επιδερμίδας και των τριχοθυλακίων βάφτηκαν κανονικά θετικά (εσωτερικός μάρτυρας).

Η χρώση της ινονεκτίνης ταξινομήθηκε ως εξής:

Πρότυπο χρώσης Ι (ΧΡ I)=Εμφανώς συνεχής ανοσοϊστοθετικότητα στην ινονεκτίνη, δηλ. ομοιογενώς κατανεμημένες, διάχυτες, διαπλεκόμενες λωρίδες κατά μήκος της χοριοεπιδερμιδικής συμβολής στα Clark I-II μελανώματα ή στο στρώμα του όγκου σε άμεση επαφή με τα κύτταρα του μελανώματος (Εικ. 1) και >75% κατά μήκος της διηθητικής παρυφής των μελανωμάτων με ευδιάκριτη κάθετη φάση ανάπτυξης (Clark III-IV). Πρότυπο χρώσης ΙΙ (ΧΡ II): Ασυνεχής ή αρνητική ανεύρεση ινονεκτίνης, π.χ. λεπτές γραμμικές ζώνες γύρω από αθροίσεις νεοπλασματικών κυττάρων όχι σε επαφή με τα κακοήθη κύτταρα, ή ελάχιστη εστιακή χρώση για ινονεκτίνη μέσα στο στρώμα του όγκου (Εικ. 2).

Όσον αφορά τη χρώση για το PCNA, τα θετικά στο PCNA νεοπλασματικά κύτταρα μετρήθηκαν στις τομές και εκφράστηκαν ως ένα μέσο εκατοστιαίο ποσοστό επί του συνόλου των κακοήθων μελανοκυττάρων που μετρήθηκαν σε δέκα τουλάχιστο αντιπροσωπευτικά πεδία μεγάλης μεγέθυνσης (Χ400). 'Εχοντας παρατηρήσει τη διακύμανση της ποσοτικής έκφρασης του PCNA στα δείγματά μας αλλά και με βάση άλλες μελέτες, χαρακτηρίσαμε τις περιπτώσεις με θετικά PCNA κακοήθη μελανοκύτταρα λιγότερα από το 3% όλων των κυττάρων του όγκου σαν περιπτώσεις με χαμηλή, πρακτικά αρνητική PCNA παρουσία.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Ινονεκτίνη

Σε συγκριτικώς εξετασθέντες ενδοδερμικούς σπίλους η ινονεκτίνη όλων των επιθηλιακών μεμβρανών ήταν άθικτη και ομοιογενώς κατανεμημένη κοντά στη χοριο-επιδερμιδική συμβολή καθώς επίσης και γύρω από τις φωλεές των σπιλοκυττάρων.

Το πρότυπο χρώσης Ι (ΧΡ I) της ινονεκτίνης παρατηρήθηκε σε 13 (27%) από τα κακοήθη μελανώματα, πιο συχνά σε άρρενες ασθενείς. Τα προχωρημένα στάδια κατά Clark συσχετίσθηκαν συχνά με το πρότυπο χρώσης ΙΙ (ΧΡ II) της ινονεκτίνης (25/31) σε αντίθεση με τα πρώιμα στάδια κατά Clark (10/17). αυτή δε η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική (p<0,05, Πίνακας 1). Πιο ειδικά, στα Clark I (in situ) μελανώματα μία γραμμοειδής βασική μεμβράνη με λίγες εστίες ακανόνιστα παχυσμένης ινονεκτίνης παρατηρήθηκε κατά μήκος της χοριο-επιδερμιδικής ένωσης, σε περιοχές όπου οι αθροίσεις των μελανοκυττάρων απωθούσαν την ακόμα άθικτη βασική μεμβράνη προς τα κάτω. Η ένταση στη χρώση της ινονεκτίνης ήταν υψηλότερη συγκριτικά με τους εξετασθέντες ενδοδερμικούς σπίλους. Στα Clark II (μικροδιηθητικά) δείγματα, στα οποία ασαφώς αφοριζόμενα νεοπλασματικά μελανοκύτταρα είναι διασκορπισμένα στο θηλώδες χόριο χωρίς να το γεμίζουν, εντοπίσθηκαν μικρά κενά ινονεκτίνης, υποδηλώνοντας μία εστιακή διάλυση της επιδερμιδικής βασικής μεμβράνης στο σημείο της διήθησης. Σε προχωρημένα στάδια Clark, στα οποία συμπαγείς αθροίσεις κυττάρων γεμίζουν το θηλώδες χόριο (Clark III) ή διηθούν το δικτυωτό χόριο (Clark IV) ή το υποδόριο λίπος (Clark V), η κατανομή της ινονεκτίνης ήταν ετερογενής.

Σε περιοχές με διάχυτη διήθηση, η ινονεκτίνη σπάνια ανιχνευόταν μεταξύ των χαλαρά συνδεδεμένων κυττάρων του όγκου. Η ανοσοϊστοθετικότητα της ινονεκτίνης εστιαζόταν κοντά στα διηθητικά όρια κάθε όγκου, ειδικά όταν μια συνοδός ινοβλαστική αντίδραση ήταν προφανής. Γενικά, όταν ο όγκος μεταχωρούσε σε συνδετικογενές στρώμα, αυτό συχνά περιείχε σημαντικές ποσότητες ινονεκτίνης. Ωστόσο, σε τελείως φυσιολογικό δέρμα, όχι ακριβώς παρακείμενα στις προσβεβλημένες περιοχές, δεν παρατηρήθηκαν ανώμαλα αυξημένες ποσότητες ινονεκτίνης.

Τέσσερις από τους 6 (67%) ασθενείς με προχωρημένο επίπεδο Clark και πρότυπο χρώσης Ι είχαν όγκους πάχους <1,5 mm και έτσι είχαν πλεονεκτική πρόγνωση σε σχέση με τους υπόλοιπους ασθενείς προχωρημένων σταδίων κατά Clark. Γενικά, 11 από τα συνολικά 13 (85%) δείγματα με ΧΡ Ι αντιστοιχούσαν σε λεπτά μελανώματα (p<0,05, Πίνακας 1). Τα οζώδη μελανώματα έκλιναν προς το πρότυπο ΧΡ II (12/14, 86%), ειδικά όταν διέθεταν διηθητικού τύπου κατώτερα όρια, αλλά όχι σε στατιστικά σημαντικό βαθμό. Το πιο ενδιαφέρον ήταν ότι η κλινική παρουσία απομεμακρυσμένων μεταστάσεων συσχετίστηκε στατιστικά με το πρότυπο ΧΡ ΙΙ της ινονεκτίνης (p<0,05). Αξίζει να παρατηρήσουμε ότι 8 από τα 18 (44%) μελανώματα με ΧΡ ΙΙ τα οποία είχαν μεταστάσεις, δεν ήταν ιδιαίτερα παχιά (Breslow <1,5 cm), αλλά όλα παρουσίαζαν σχετικά υψηλά ποσοστά μελανοκυττάρων θετικών για το PCNA. Η ασυνεχής ή αρνητική χρώση για ινονεκτίνη (XΡ II), από μόνη της συσχετίστηκε με προχωρημένα κλινικά στάδια στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας του 5%. Εντούτοις, όταν συνυπήρχαν υψηλές τιμές PCNA η προκύπτουσα στατιστική σημαντικότητα ήταν υψηλότερη (p<0,01, Πίνακας 2). Παρ' όλα αυτά, τα 2 πρότυπα χρώσης της ινονεκτίνης, όπως αξιολογήθηκαν σ' αυτή την έρευνα, δεν συσχετίστηκαν εκλεκτικά με υψηλές ή χαμηλές τιμές PCNA.

PCNA

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, ο μέσος όρος κυττάρων θετικών στο PCNA για τα μελανώματα (3,851% του συνόλου των κακοήθων κυττάρων σε όλους του κακοήθεις όγκους) ήταν σημαντικά υψηλότερος από τον αντίστοιχο για τους κοινούς ενδοδερμικούς σπίλους (0,321%) (p<0,001, Πίνακας 3). Το μέσο ποσοστό θετικών στο PCNA μελανοκυττάρων στα μελανώματα επιπέδου Ι κατά Clark (1,238%) ήταν αρκετά υψηλότερο απ' αυτό των κοινών μελανοκυτταρικών σπίλων (0,321%). ένα εύρημα ενδεικτικό ότι τα κύτταρα στο μη διηθητικό (in situ) μελάνωμα πολλαπλασιάζονται ενεργά. Το ποσοστό θετικότητας των πρώιμων επιπέδων κατά Clark ήταν σημαντικά χαμηλότερο του αντιστοίχου των καθαρά διηθητικών μελανωμάτων (Πίνακας 3). Σε μερικές περιπτώσεις παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη ποικιλία στη θετικότητα για το PCNA από περιοχή σε περιοχή μέσα στην ίδια αλλοίωση. Επίσης, κακοήθη μελανώματα με σχετικά άφθονη μελανίνη δεν παρουσίασαν τόσα πολλά PCNA θετικά κύτταρα, όσα τα αμελανωτικά μελανώματα. Η αναγνώριση του PCNA παρατηρήθηκε σε κύτταρα του όγκου τόσο στην επιδερμίδα όσο και στο χόριο, αλλά τα θετικά στο PCNA κύτταρα των μελανωμάτων ανευρίσκονταν πιο συχνά στην κάθετη φάση ανάπτυξης παρά στην επίπεδη. Επιπροσθέτως υπήρχε μία τάση τα θετικά στο PCNA μελανοκύτταρα να είναι αραιά κατανεμημένα στις επιδερμιδικές βλάβες και πιο πυκνά και ομοιόμορφα κατανεμημένα σε βαθιές διηθήσεις του χορίου.

Υψηλά ποσοστά θετικής έκφρασης του PCNA βρέθηκαν σε 18 (37,5%) κακοήθη μελανώματα. Η υψηλή ανοσοϊστοθετικότητα στο PCNA δε συσχετίσθηκε με το πάχος του όγκου, την εξέλκωση της επιδερμίδας, την αγγειακή διήθηση, την παρουσία διηθητικού τύπου παρυφής ή το κλινικό στάδιο. Αντιθέτως, συνεβάδιζε με απουσία της επίπεδης φάσης ανάπτυξης (οζώδης ιστολογικός τύπος), με ικανή μιτωτική δραστηριότητα, με προχωρημένο βάθος διήθησης (όπως ορίζεται από τα επίπεδα κατά Clark) (Πίνακας 4).

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Το πρωταρχικό βήμα στη διαδικασία της μετάστασης είναι η απελευθέρωση και μετανάστευση κυττάρων από τον πρωτοπαθή όγκο. μία διαδικασία μέχρι την οποία τα κακοήθη κύτταρα έχουν αλληλεπιδράσει αρκετές φορές με τα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας, αρχικά των βασικών μεμβρανών και κατόπιν του στρωματικού ιστού¹⁹. Κατά κανόνα, στον καρκίνο η ινονεκτίνη απουσιάζει από τις επιφάνειες των κυττάρων, όπως επίσης και από τη μάζα του όγκου, είναι δε μειωμένη και στις βασικές μεμβράνες ανάλογα με το βαθμό διήθησης⁶. Σ' αυτή την έρευνα, η ανεύρεση της ινονεκτίνης συσχετίστηκε με μειωμένη κλινικά μεταστατική ικανότητα, μόνο όταν ένα συνεχές πρότυπο χρώσης διατηρείτο. Αυτό το συγκεκριμένο πρότυπο συσχετίστηκε με λεπτά μελανώματα, τα οποία ούτως ή άλλως είχαν ένα προγνωστικό πλεονέκτημα.

Το συνεχές πρότυπο της ινονεκτίνης παρατηρήθηκε και σε επιφανειακά και σε βαθύτερα επίπεδα Clark με μια προφανή, στατιστικά σημαντική προτίμηση για τα πρώτα. Λαμβάνοντας υπόψη την πρόσφατη βιβλιογραφία, όπως επίσης και το γεγονός ότι τα επίπεδα διήθησης κατά Clark αντικατοπτρίζουν τη βαθμιαία απόκτηση βιολογικών ιδιοτήτων, που σχετίζονται με την κακοήθη συμπεριφορά των κυττάρων του μελανώματος¹⁵, μπορούμε να υποθέσουμε ότι η συνέχεια της ινονεκτίνης ασκεί ένα σύνθετο ρόλο στην εξέλιξη του όγκου, που εξαρτάται από το επίπεδο στο οποίο εκφράζεται. Αν και τα μελανοκύτταρα αυτά καθ' αυτά δεν έχουν στρώμα ινονεκτίνης, τα κακοήθη μελανώματα μπορεί να αναπτυχθούν σε περιοχές που περιέχουν ινονεκτίνη⁶. Μαζί με διάφορες αποδιοργανωτικές αλλαγές στην χοριο-επιδερμιδική ένωση, στα Clark Ι και ΙΙ μελανώματα η συνεχής χρώση ινονεκτίνης (ΧP I) σε συνδυασμό με τη διατήρηση ανέπαφων όλων των κύριων συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας²⁰, είναι πιθανό να ευνοεί την επέκταση του όγκου²¹. Η τελευταία έχει σχέση με την εξαρτώμενη από την ινονεκτίνη αναφερόμενη προαγωγή της μετανάστευσης μερικών πολύ επιθετικών μελανοκυττάρων στην εξωκυττάρια ουσία. Αυτά τα συγκεκριμένα μελανοκύτταρα αποσπώνται από την κανονική επιδερμίδα, πιθανώς αφού χάσουν τους ειδικούς υποδοχείς διακυττάριας προσκόλλησης. Στα επιφανειακά μελανώματα οι αλληλεπιδράσεις κυττάρων-στρώματος επιτυγχάνονται χάρη στη μεσολάβηση ιντεγκρινών (ενσωματινών)1,22-31 της κυτταρικής επιφάνειας, στις οποίες συμπεριλαμβάνεται ο κλασσικός υποδοχέας² ινονεκτίνης που απαντάται στη μεταστατική σειρά μελανοκυττάρων C 8161²³. Η ινονεκτίνη περιέχει τουλάχιστο δύο ξεχωριστές ολιγοπεπτιδικές αλληλουχίες που χρησιμεύουν σαν σημάδια για την αλληλεπίδραση με τις ιντεγκρίνες. Πολλοί παράγοντες (π.χ. η α-θρομβίνη) έχουν την ικανότητα να αυξάνουν την προσκόλληση των κυττάρων του μελανώματος στην ινονεκτίνη. αναμφισβήτητα μια ουσιώδης προϋπόθεση για την επίτευξη της εισβολής. Απ' την άλλη μεριά, άλλα μόρια μεταξύ των οποίων οι μεταλλαγμένες γλυκοζυλιωμένες β-1 ιντεγκρίνες έχουν ένα αντίθετο, αντι-προσκολλητικό και έτσι αντιμεταστατικό αποτέλεσμα. Περαιτέρω έρευνα που αφορά τις φαινοτυπικές αλλαγές των κυττάρων του μελανώματος χρειάζεται ούτως ώστε να ξεκαθαριστεί ο λειτουργικός ρόλος της ινονεκτίνης στο μηχανισμό της προσκόλλησης των κυττάρων του όγκου στην εξωκυττάρια ουσία. Εντούτοις, το αντιμεταστατικό αποτέλεσμα ορισμένων θεραπευτικών παραγόντων που αναστέλλουν την προσκόλληση του πεπτιδίου της ινονεκτίνης στα κύτταρα, σε συνδυασμό με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα είναι πολλά υποσχόμενο³². Επιπλέον, ορισμένα χημειοθεραπευτικά φάρμακα, όπως η αδριαμυκίνη δρουν επηρεάζοντας την προσκολλητικότητα των μελανοκυττάρων στην ινονεκτίνη³³.

Αντίστροφα, σε καθαρά διηθητικές βλάβες η πιθανότητα εύρεσης της ΧΡ I της ινονεκτίνης είναι αναμενόμενα μειωμένη: παρατηρήθηκε μόνο στο 16% των Clark III-V των δειγμάτων σε αντίθεση με το 47% των Clark I και ΙΙ περιπτώσεων (p<0,05). Η ΧP I της ινονεκτίνης όταν παρατηρείται κατά μήκος του διηθητικού ορίου ενός σαφώς διηθητικού όγκου, πιθανώς έχει έναν ευνοϊκό, περιοριστικό του όγκου ρόλο, καθώς σ' αυτές τις συγκεκριμένες βλάβες οι κακοήθεις σχηματισμοί διατηρούν ακόμη συνεχείς βασικές μεμβράνες⁵. Επιπροσθέτως, είναι γνωστό ότι η ινονεκτίνη μπορεί να προάγει ευνοϊκές ανοσολογικές αντιδράσεις, όπως είναι η φαγοκύτωση.

Η αυξημένη επίπτωση της ΧΡ I της ινονεκτίνης στους άρρενες ασθενείς θα μπορούσε να αποδοθεί στο γεγονός ότι το μέσο επίπεδο ινονεκτίνης του πλάσματος¹ είναι υψηλότερο για τους άνδρες απ' ότι για τις γυναίκες⁶.

Σε περιοχές του όγκου με αυξημένη έκφραση του PCNA, η ινονεκτίνη ήταν τοπικά αυξημένη στις περιβάλλουσες εξωκυττάριες δομές, αλλά αυτοί οι όγκοι δεν χαρακτηρίζονταν γενικά από ένα συνεχές πρότυπο χρώσης της ινονεκτίνης. Ούτως ή άλλως, αυτή η μορφολογική παρατήρηση βρίσκεται σε αρμονία με το γεγονός ότι μια ανώμαλα αυξημένη ποσότητα ινονεκτίνης είναι παρούσα σε περιοχές όπου συμβαίνει αυξημένος κυτταρικός πολλαπλασιασμός⁶.

Το πιο ενδιαφέρον από το ευρήματά μας ήταν η στενή σχέση μεταξύ της ΧΡ II σ'ενα διηθητικό κακόηθες μελάνωμα με την πιθανότητα τοπικής λεμφαδενικής μετάστασης. Στις περιπτώσεις αυτές η λεμφαδενεκτομή μπορεί να έχει ένδειξη ανεξαρτήτως της κλινικής εμφάνισης των λεμφαδένων. Εντούτοις, η σχέση μεταξύ της ΧΡ II και του προχωρημένου κλινικού σταδίου ενισχύεται περισσότερο όταν ταυτόχρονα ανευρίσκονται υψηλές τιμές PCNA στον κακοήθη πληθυσμό. 'Ετσι, η συνέχεια της ινονεκτίνης και η κυτταρική κινητική αξίζουν να μελετηθούν συγκριτικά σε περαιτέρω σειρές.

Σ' αυτή την έρευνα ο αυξημένος δείκτης πολλαπλασιασμού όπως εκτιμήθηκε ανοσοϊστοχημικά από τη θετικότητα στο PCNA, συσχετίσθηκε με αρκετούς δυσμενείς προγνωστικούς δείκτες, αλλά σ' αυτούς δεν συμπεριλαμβάνονταν τα μη ευνοϊκά κλινικά στάδια όπως σε κάποιες άλλες μελέτες^11,34-37. Είναι σχεδόν αυταπόδεικτο ότι ένας ταχέως πολλαπλασιαζόμενος όγκος θα είναι περισσότερο επικίνδυνος από έναν που πολλαπλασιάζεται πιο αργά. Οι παρατηρηθείσες τιμές θετικών PCNA κυττάρων στην παρούσα μελέτη ήταν γενικά αρκετά χαμηλότερες σε σύγκριση με άλλες μελέτες στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν παρόμοιοι κλώνοι αντισωμάτων. Αυτή η ποσοτική ασυμφωνία μπορεί να δικαιολογηθεί από το γεγονός ότι η αντιγονικότητα του PCNA είναι ασθενής καθώς κατεξοχήν επηρεάζεται από τον τρόπο της μονιμοποίησης. Στην παρούσα όπως και σε άλλες έρευνες³⁶, ο μιτωτικός δείκτης συσχετίστηκε με την θετική έκφραση του PCNA. Η ποσοτική εκτίμηση της μιτωτικής δραστηριότητας από μόνη της μπορεί να υποτιμήσει τη δυνατότητα πολλαπλασιασμού του όγκου. Ο σκοπός της εκτίμησης του πολλαπλασιασμού είναι ότι παρέχει την ικανότητα της ανακάλυψης ενεργώς πολλαπλασιαζομένων κυττάρων που συνθέτουν DNA και που έχουν περισσότερες πιθανότητες να ανακαλυφθούν με την ανοσοϊστοχημική χρώση για το PCNA^38,39. Εντούτοις, υπάρχουν πρόσφατες ενδείξεις ότι μερικοί αυξητικοί παράγοντες μπορούν να αυξήσουν τη σταθερότητα του mRNA του PCNA και συνεπώς να θετικοποιήσουν την έκφραση του PCNA, χωρίς αυτό απαραίτητα να συνεπάγεται σύνθεση DNA. Επιπλέον, η αυξημένη ανεύρεση του PCNA μπορεί να οφείλεται σε γονιδιακή απορρύθμιση, ένα φαινόμενο που αναφέρθηκε πρόσφατα μέσα και γύρω από ορισμένα νεοπλάσματα.

Το εύρημά μας ότι τα οζώδη μελανώματα επιδεικνύουν μεγαλύτερη μιτωτική δραστηριότητα απ' ότι τα υπόλοιπα, αντανακλά τον υψηλότερο βαθμό κακοηθείας αυτού του υποτύπου και γενικότερα της κάθετης φάσης ανάπτυξης. Γενικά η ανοσοϊστοθετικότητα για το PCNA εντοπιζόταν εκλεκτικά στα μελανοκύτταρα των βαθύτερων στρωμάτων της κάθετης φάσης ανάπτυξης, τα οποία ουσιαστικά αποτελούν το επικίνδυνο τμήμα του νεοπλάσματος - αφού έχουν περισσότερες πιθανότητες να μετασταθούν⁴⁰. Ενδιαφέρον είναι ότι στις 4 περιπτώσεις μας με υποστροφή της επίπεδης φάσης ανάπτυξης, σχεδόν όλα τα λίγα εναπομείναντα κύτταρα μελανώματος ήταν PCNA θετικά -ένα εύρημα ενδεικτικό αυξημένης μεταστατικής ικανότητας αυτών των κυττάρων¹⁵. Εκτός από τον οζώδη τύπο, τα κακοήθη μελανοκύτταρα παραμένουν στην επιδερμίδα για μεγάλο διάστημα πριν ξεκινήσει η κάθετη ανάπτυξη. Ως εκ τούτου, το ποσοστό πολλαπλασιασμού των καθαρά διηθητικών (Clark III-V) κακοήθων μελανωμάτων έχει σωστά θεωρηθεί υψηλότερο από εκείνο των in situ ή μικροδιηθητικών βλαβών⁴¹. Σ'αυτή την έρευνα, η βαθμιαία αύξηση του PCNA ήταν ανάλογη με το ανατομικό επίπεδο διήθησης, αλλά όχι με το βάθος διήθησης κατά Breslow σε χιλ. αυτό υποδηλώνει ότι +η βιολογική συμπεριφορά των μελανοκυττάρων και ο πολλαπλασιασμός τους γενικά, είναι στενά συνδεδεμένα με διακριτά τοπογραφικά ανατομικά επίπεδα, κάθε ένα από τα οποία χαρακτηρίζεται και από ένα συγκεκριμένο μικροπεριβάλλον.

Επιπλέον, η υπόθεση ότι η έκφραση του PCNA θα έπρεπε να συσχετισθεί με υψηλούς βαθμούς κακοηθείας ενισχύεται από την παρατήρησή μας ότι μελανοκύτταρα με σχετικά άφθονη μελανίνη δεν ήταν σχεδόν ποτέ PCNA θετικά. Αυτά τα μελανοκύτταρα είναι πιο διαφοροποιημένα και έτσι έχουν λιγότερη αυξητική δραστηριότητα απ' ότι τα μελανοκύτταρα χωρίς καθόλου μελανίνη.

Συμπερασματικά, μετά τη διάσπαση της βασικής μεμβράνης τα κακοήθη μελανοκύτταρα αργά ή γρήγορα θα απαρτίσουν το επικίνδυνο, βαθύτερο τμήμα του όγκου⁴⁰, το οποίο σ' αυτή τη μελέτη χαρακτηρίζονταν από αυξημένη ικανότητα πολλαπλασιασμού και βιολογική επιθετικότητα. Αυτοί οι παράγοντες ωστόσο, είναι πιθανό να χειροτερέψουν την πρόγνωση και να οδηγήσουν σε κλινική εξάπλωση του όγκου, μόνο όταν ένα ασυνεχές ή εντελώς αρνητικό πρότυπο χρώσης ινονεκτίνης χαρακτηρίζει τις βασικές μεμβράνες στο στρώμα του όγκου.

Βιβλιογραφία